目的：基于临床实验室建立一种高特异性液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）技术方法，以快速准确检测不同年龄人群的血清维生素A、25羟维生素D3[25（OH）D3]和维生素E水平。方法：采用液-液萃取前处理，建立LC-MS/MS法检测血清中维生素A、25（OH）D3和维生素E的方法，并通过基质效应、线性、精密度测定、加样回收率等对此方法进行评价。收集健康体检人群标本542例，分析不同年龄组即青少年（1～18岁组）、中年（19～59岁组）和（老年≥60岁组）血清维生素A、25（OH）D3和维生素E水平，并依据卫生行业标准（WS/T553-2017和WS/T677-2020）判断不同年龄段维生素A、25（OH）D3和维生素E营养状况。结果：采用LC-MS/MS技术同时检测血清维生素A、25（OH）D3和维生素E的总检测时间为6.5 min，未见明显干扰因素。标准曲线相关系数r2＞0.99。维生素A、25（OH）D3和维生素E批内不精密度均＜6.0%，批间不精密度＜7.5%。加标回收率均在100.5%～112.9%。不同年龄组中1～18岁组未见到维生素A缺乏；7～18岁组维生素A不足占8.96%;25（OH）D3缺乏和不足分别占10.12%和38.10%；维生素E不足占5.06%;19～59岁组维生素A和E较少见到缺乏，25（OH）D3缺乏和不足分别占20.90%和46.33%；≥60岁组维生素A、25（OH）D3和维生素E缺乏和不足总和分别占16.36%、87.3%和12.72%。结论：建立的LC-MS/MS技术方法能够快速准确地检测血清维生素A、25（OH）D3和维生素E水平。在1～18岁和≥60岁人群中存在一定程度的维生素A、25（OH）D3和维生素E的缺乏，各年龄段均显示25（OH）D3缺乏和不足。