目的 研究16S rRNA基因序列鉴定标本中病原微生物的关键技术,评价序列分析技术作为病原微生物检测方法的可行性和实用性.方法 对117份不同来源的临床标本分别采用形态学、细菌培养、16S rRNA基因扩增与测序分析,比较不同方法对病原菌检出的灵敏度与特异性.分子技术通过改良的微量核酸提取方法,扩增16S rRNA基因两个区域(BSF8-BSR534和BAK11w-BAK2).结果 细菌培养和PCR检测的阳性率分别是49%(57/117)和72%(84/117),63%(53/84)的PCR产物通过直接测序鉴定到种;60例(52%)培养阴性标本中有7例(12%)经序列分析再次鉴定出病原菌;形态学检查阳性率为64%(75/117),与PCR结果接近,两者结合可提供推测性报告.第1对引物(扩增区:BSF8-BSR534)较适合革兰阳性细菌分类,第2对引物(扩增区:BAK11w-BAK2)对临床常见病原菌均可获得理想的序列.结论 改进核酸提取技术、筛选恰当的引物、优化基因扩增和测序流程,通过16S rRNA基因序列直接鉴定标本中病原微生物有着广阔的应用前景.