资源类型：
专利
申请人：
首都医科大学附属北京同仁医院
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北京华声医学科技开发公司
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当前专利权人：
首都医科大学附属北京同仁医院
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北京华声医学科技开发公司
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申请号：
CN202410747914.8
申请日期：
2024-06-11
授权年份：
2025
公开号：
CN118652996A
公开日：
2024-09-17
法律状态：
有效
主分类号：
C12Q1/6895
分类号：
C12Q1/6895 C12Q1/6841 C12N15/11 C12R1/66
摘要：
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种组织原位检测用曲霉菌属鉴别用原位分子标记探针、试剂盒及曲霉菌属的鉴别方法。所述分子标记探针，包括碱基序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的寡核苷酸，通过对前述寡核苷酸进行标记物标记可得到用于鉴别曲霉菌属的探针。基于所述探针，本发明还开发了相应的曲霉菌属鉴别试剂盒及曲霉菌属的鉴别方法。本发明的原位分子标记探针被证实可快速且高灵敏、高特异性地鉴别出感染的致病真菌病原体是否属于曲霉菌属，这将有利于及早确定准确的抗真菌治疗方案。本发明为侵袭性真菌病确诊曲霉菌属感染提供了高效和可靠的检测手段。
主权项：
1.一种基于非诊断目的的曲霉菌属的组织原位鉴别方法，其特征在于，采用原位分子标记探针进行检测鉴别；所述检测方法包括如下步骤： (1)以组织石蜡切片为检测样本，将4μm石蜡切片烤片，65℃，2h； (2)脱蜡复水：二甲苯脱蜡，室温，10min，重复3次；无水乙醇，室温，3min；90％乙醇，室温，3min；70％乙醇，室温，3min；纯水，室温，3min，洗涤； (3)通透：1％Triton X-100，室温，20min；纯水，室温，3min，洗涤； (4)修复：1×EDTA，98℃，6min；纯水，室温，3min，洗涤； (5)阻断内源性过氧化物酶：3％H2O2，室温，10min，纯水，室温，3min，洗涤； (6)真菌细胞壁消化：溶菌酶10mg/mL，37℃，20min，纯水，室温，3min，洗涤； (7)消化:胃蛋白酶B工作液，37℃，30min； (8)终止消化：纯水，室温，3min，洗涤，2次； (9)脱水：70％乙醇，室温，3min；90％乙醇，室温，3min；无水乙醇，室温，3min； (10)加探针：8-10μL/张，盖上盖玻片，封片胶封闭盖玻片边缘；所述探针的碱基序列为SEQ ID NO.1所示，地高辛在SEQ ID NO.1所示碱基序列的3’-端进行标记； (11)杂交：杂交仪，42℃，2h或3h； (12)揭片、洗涤：用镊子除去封片胶，50％甲酰胺，37℃，5min，3次； (13)抗地高辛抗体孵育：37℃，30min； (14)洗涤：PBST，室温，2min，3次； (15)DAB显色：按DAB显色规程进行DAB显色，室温，5min； (16)洗涤：纯水，室温，2min，3次； (17)复染：苏木素，室温，10min； (18)返蓝：返蓝液，室温，2min； (19)脱水：70％乙醇，室温，3min；90％乙醇，室温，3min；无水乙醇，室温，3min； (20)封片：封片胶封片，在显微镜下进行镜检。
