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本发明涉及一种高效检测血清中抗视网膜抗体(ARAs)的方法，包括下述步骤：(1)抽取临床疑似AIR患者静脉血，离心，得到患者血清；(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物，采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数，即ARAs数量；(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物，采用蛋白印迹法检测并确认患者血清中存在的ARAs种类；(4)采用免疫荧光法检测患者血清中的ARAs，将其定位于正常人视网膜组织切片中，得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位；(5)根据步骤(2)、(3)、(4)得到的患者血清ARAs检测结果，确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位，建立临床疑似AIR患者的血清学指标。本发明的检测方法灵敏度和特异性高，适用于临床早期检测。
主权项：
1.一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法，包括下述步骤： （1）抽取临床疑似AIR患者静脉血，离心，得到患者血清； （2）以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物，采用蛋白印迹法检测步骤（1）抽取得到的患者血清中抗体阳性条带数，即ARAs数量； 所述正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白的方法为：将视网膜置于组织匀浆器内，0.5mL组织裂解液研磨5-10min，4℃下12000rpm/min离心 20min, 取上清液，即得视网膜蛋白；所述组织裂解液为: 50mmol/L pH8.0的 Tris·Cl、150mmol/L NaCl、0.02%叠氮钠、100µg/mL PMSF、1µg/mL Aprotitin、1%Triton X-100或NP-40；蛋白印迹法检测所采用的正常人视网膜蛋白浓度为6.25μg/μL； （3）以已知人重组蛋白抗原为反应底物，采用蛋白印迹法检测并确认步骤（1）抽取得到的患者血清中存在的ARAs种类； （4）采用免疫荧光法检测步骤（1）制得患者血清中的ARAs，将其定位于正常人视网膜组织切片中，得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位； （5）根据步骤（2）、（3）、（4）得到的患者血清ARAs检测结果，确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位，建立临床疑似AIR患者的血清学指标； 步骤（2）中采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数的方法，包括下述步骤： ①将浓度为6.25μg/μL的正常人视网膜蛋白上样至三个泳道孔，毎孔上样8μL，以100V*100min电泳，100V*60min转膜，将转印后的PVDF膜置于浓度为5%的脱脂奶粉中封闭60min； ②把封闭后的PVDF膜按泳道切分成两块，分别作为实验组和阴性对照组，其中，所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清，阴性对照直接加PBS而不加临床疑似AIR患者血清，均淹没PVDF膜，4℃孵育过夜，所述PBS为磷酸盐缓冲盐溶液； ③取出各个PVDF膜，用PBS漂洗干净后，再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗并淹没PVDF膜，室温孵育60min，加入ECL荧光剂，发光显影，观察阳性抗体条带数，总阳性抗体条带数即为患者血清中的ARAs数量； 所述采用免疫荧光法检测患者血清ARAs的方法包括如下步骤：将患者血清滴加到正常人视网膜的切片上，再加入抗人IgG荧光抗体，利用显微镜观察荧光阳性染色，观察阳性染色位于视网膜组织中的位置，确认ARAs在视网膜组织中的位置。
