目的:探索二代测序（NGS）技术检测超声引导下细针穿刺活检（US-FNA）单发甲状腺微小结节（TMN）标本中BRAF、RAS、TERT启动子和TP53基因突变情况及其诊断甲状腺微小癌（TMC）的价值。方法:现场招募2018年9月至2021年7月于首都医科大学附属北京同仁医院住院及门诊接受甲状腺超声检查、超声可疑单发TMC且随后进行了US-FNA及NGS的428例TMN患者，最终纳入147例患者。采用NGS技术对US-FNA标本进行BRAF、RAS、TERT启动子和TP53基因突变检测。对比BRAF基因突变组与非基因突变组患者年龄、性别及结节最大径的差异。以术后病理诊断为金标准，通过受试者工作特征（ROC）曲线计算BRAF基因突变诊断TMC的效能。结果:147例患者的年龄［ M（ Q1， Q3）］为43.0（32.0，51.0）岁，男37例（25.2%）。147份US-FNA标本中，97份（66.0%）检测出BRAF基因突变，全部为p.V600E点突变；6份（4.1%）检测出RAS基因突变，未检出TERT启动子和TP53基因突变。术后病理证实136例（92.5%）为TMC，病理类型全部为甲状腺微小乳头状癌（PTMC）；11例（7.5%）为良性。其中，136份TMC标本中有97份（71.3%）检测出BRAF基因突变。BRAF基因突变组患者年龄、性别及结节最大径与非BRAF基因突变组差异均无统计学意义（均 P>0.05）。TMN中BRAF基因突变诊断TMC的灵敏度和特异度分别为71.3%及100.0%，ROC曲线下面积（AUC）（95% CI）为0.857（0.789~0.925）；Bethesda Ⅲ~Ⅴ类TMN中BRAF基因突变诊断TMC的灵敏度和特异度分别为63.0%及100.0%，AUC（95% CI）为0.815（0.680~0.950）。 结论:NGS技术可成功检测TMN患者US-FNA标本中多基因突变情况，尤其是BRAF基因突变，且BRAF基因突变对于诊断TMC有一定价值。