摘要：
目的 建立一种无致癌性、无放射性、灵敏的3,3',5,5',--四甲基联苯胺(TMB)检测ADCC实验中靶红细胞自然释放的微量Hb含量的改进方法.方法 利用Hb类似过氧化物酶效应催化双氧水氧化3,3',5,5'--四甲墓联苯胺(TMB),使其发生显色反应,改进吸光度在600mm处的检测体系.采用Nycodenz密度渗透压介质分离单核细胞作为ADCC的效应细胞.比较2种情况的灵敏度,并与51Cr释放法进行方法学对照.在 ADCC实验中,分别用s51Cr释放法和改良TMB法测定Hb自然释放率.结果 显色反应结束后加硫酸酸终止测定最大吸收波长移至450 nm,不加酸终止测定波长为600nm.不加硫酸终止的TMB法检测Hb低检出限是0.0075g/L,显色时间20min,TMB最优浓度是0.62g/L,空白吸收始终稳定的维持在＜0.003的较低值.而加酸终止的TMB法低检出限仅为0.5g/L.显然不加酸终止的改良TMB法的灵敏度非常显著地高于加酸终止的TMB法.在测定ADCC靶红细胞自然释放率试验中,不加酸终止的改良TMB法仅需4h孵育时间以及2.5x106cell/ml红细胞浓度即可测定出释放Hb含量,而加酸后孵育时间要长达14h并且19要更高浓度的红细胞才能测出自然释放Hb含量.用不加硫酸终止的TMB法检测ADCC活性与51Cr释放法相关性良好(r=0.999).结论 改良TMB比色法可以代替,51Cr释放法检测ADCC的靶红细胞细胞毒效应.加酸终止、测定波长为450 nm的TMB比色法的灵敏度与51Cr释放法的灵敏度有显著差距,不适用低活性ADCC效应检测.
