摘要:
目的构建核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3,NLRP3)基因3’非编码区(untranslated region,UTR)野生型及突变型双荧光素酶报告质粒载体,分析微小RNA(miR)-22-3p对NLRP3的调控作用。方法应用生物信息软件预测miR-22-3p与NLRP3基因的结合位点;将NLRP3基因的3’UTR序列及其突变体克隆到双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中,构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及基因测序方法鉴定载体是否构建成功;将培养的人胚肾293T细胞(HEK293T)分为4组:(1) miR-22-3p对照+psi CHECK2;(2) miR-22-3p对照+psi CHECK2-NLRP3-3’UTR(野生型);(3) miR-22-3p模拟物(mimic)+psi CHECK2-NLRP3-3’UTR(野生型);(4) miR-22-3p模拟物(mimic)+psi CHECK2-NLRP3-3’UTRmut(突变型),分别检测细胞荧光素酶活性。结果成功构建了NLRP3基因3’UTR野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体; NLRP3-3’UTR野生型与miR-22-3p mimic共转染293T细胞后,荧光素酶活性降低,下降43%,差异有统计学意义(P (0. 05)。结论成功构建NLRP3基因3’UTR双荧光素酶报告质粒载体并初步验证miR-22-3p对NLRP3的调控作用。