摘要：
目的 构建新糖基转移酶基因Glt8d2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗Glt8d2蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增Glt8d2目的基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-Glt8d2.转化大肠埃希菌BL21,异丙基-D-半乳糖苷诱导并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析、Western印迹分析、生物质谱分析证实Glt8d2重组蛋白表达正确.大量表达后利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗Glt8d2蛋白的多克隆抗体.以纯化的Glt8d2重组蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western印迹和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测.结果 扩增获得Glt8d2基因片段,成功表达了Glt8d2重组蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳和Western印迹分析得到证实.成功获得重组蛋白及兔抗Glt8d2多克隆抗体.ELISA检测证实多克隆抗体效价>l:320 000.免疫组织化学分析显示,该基因编码的糖基转移酶在肝实质细胞内呈胞质模式表达分布.结论 利用大肠埃希菌BL21能够成功表达Glt8d2重组蛋白,获得高特异性、高效价兔抗Glt8d2重组蛋白的多克隆抗体,为今后研究Glt8d2基因的生物学功能研究奠定了基础.
