目的:在耻垢分枝杆菌内过表达结核分枝杆菌Rv2333c,探究结核分枝杆菌Rv2333c在细菌侵染巨噬细胞过程中所发挥的功能.方法:构建表达Rv2333c基因的重组质粒pSUM-MCS2-Rv2333c,进而得到过表达Rv2333c的耻垢分枝杆菌菌株;用空载菌株(Ms_Vec)和过表达菌株(Ms_Rv2333c)感染巨噬细胞,并在不同时间点收集样品.随后进行细菌胞内存活实验,检测乳酸脱氢酶(LDH)含量以分析Rv2333c对巨噬细胞毒性的影响;之后通过提取细胞样品的RNA、上清培养液和细胞沉淀裂解物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白免疫印迹(Western blotting)等技术检测Rv2333c对巨噬细胞内相关细胞因子的分泌,以及核因子激活B细胞的κ-轻链增强(NF-κB)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)等通路的影响.结果:实验成功构建了 Rv2333c表达载体,并获得过表达Rv2333c的重组耻垢分枝杆菌.Ms_Rv2333c菌株感染巨噬细胞后,细胞毒性检测LDH结果显示:Rv2333c在侵染巨噬细胞早期(6 h)即对宿主的毒性明显下降[Ms_Vec:(52.55±0.90)％,Ms_Rv2333c:(27.87±1.77)％;t=17.560,P＜0.001],但不影响细菌胞内菌落形成单位(log10CFU)的增殖(Ms_Vec:7.45±0.05,Ms_Rv2333c:7.35±0.16;t=1.069,P=0.345).RT-PCR 结果显示:Rv2333c可使巨噬细胞内早期(6 h)白细胞介素(IL)1βmRNA水平(2-△△Ct值)表达下调(Ms_Vec:657.43±20.96,Ms_Rv2333c:521.36±25.97;t=5.767,P=0.005),而在侵染后期(48 h)则促进其表达上调(Ms_Vec:1548.53±125.17,Ms_Rv2333c:2168.13±130.00;t=4.855,P=0.008);但 Rv2333c 在感染早期(6 h)和晚期(48 h)均可使IL-6 mRNA 表达上调(Ms_Vec:2.46±0.49 和 776.41±15.38,Ms_Rv2333c:6.02±0.37 和 1642.76±51.15;t值分别为8.234和22.940,P值分别为0.001和＜0.001);同时也均上调γ-干扰素(IFN-γ)mRNA的表达(Ms_Vec:2.52±0.09 和 2.76±0.32,Ms_Rv2333c:17.24±0.47 和 8.52±0.08;t值分别为 43.760 和 25.090,P 值均＜0.001).Western blotting结果显示:Rv2333c可使巨噬细胞内NF-κB表达和ERK1/2磷酸化水平在3 h时即明显上升[Ms_Vec:(1.00±0.14)％和(1.00±0.06)％,Ms_Rv2333c:(1.85±0.29)％和(1.74±0.03)％;t值分别为3.765 和 15.040,P值分别为 0.020 和＜0.001],至 24 h 时仍明显上升[Ms_Vec:(1.00±0.14)％和(1.00±0.02)％,Ms_Rv2333c:(1.45±0.15)％和(1.17±0.04)％;t值分别为 3.041 和 5.538,P 值分别为 0.038 和 0.005].结论:Rv2333c在结核分枝杆菌致病过程中起到非常重要的作用.在结核分枝杆菌侵染巨噬细胞早期Rv2333c即可发挥抑制细胞凋亡的作用,有助于细菌在胞内存活.但在侵染中后期,Rv2333c可通过促进巨噬细胞炎症因子mRNA的表达诱导细胞发生炎症反应并参与其中.还可通过影响ERK1/2的磷酸化间接参与NF-κB转移进入细胞核及调控转录因子的活动.