目的建立测定SD大鼠血浆中L-5-甲基四氢叶酸钙（5-MTHF）浓度的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS法）,初步考察5-MTHF在SD大鼠体内的药代动力学（PK）参数。方法给予6只雄性SD大鼠口服1.5×10-2mmol·L-1·kg-15-MTHF,采集血样用于HPLC-MS/MS分析。用蛋白沉淀法处理血浆样本,色谱柱:Grace Altima HP C18,流动相A:甲醇-乙腈-异丙醇-乙醇-水-甲酸-二甲基亚砜（25∶25∶25∶25∶0.1∶1）;流动相B:甲醇-水-甲酸（10∶90∶0.1）;梯度洗脱:0.40 mL·min-1。考察该方法的线性范围、准确度和精密度、回收率、基质效应及稳定性。用WinNonlin软件计算5-MTHF在SD大鼠体内的PK参数。结果 5-MTHF在10.001.00×104ng·mL-1内线性关系良好,回归方程为y=1.01×10-3x+1.82×10-3（r=0.998 3）,日内和日间的准确性和精密度、回收率、基质效应及稳定性符合要求。5-MTHF在SD大鼠体内的PK参数:不扣除本底5-MTHF浓度值的t1/2为（15.23±5.76）h,AUC0t为（2788.52±348.86）ng·mL-1·h,扣除本底5-MTHF浓度值的t1/2为（1.57±0.34）h,AUC0t平均值为（971.80±237.58）ng·mL-1·h。结论本研究建立了一种灵敏的、准确的用于SD大鼠血浆中5-MTHF浓度测定的HPLC-MS/MS法。